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发布时间:2022-04-21 21:45:37 来源:ayx爱游戏网页版 作者:爱游戏最新版下载访问次数:

 

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  蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)以蛋白质为研究对象,先借助SDS-PAGE凝胶,将总蛋白按照不同的分子量大小进行分离,然后将胶上的蛋白质转移到膜上,再利用相应的特异性抗体对靶蛋白进行定量或定性检测的方法。

  从Stark团队建立了蛋白印记的方法至今,始终如一的实验技术流程,造就了Western blot的经典所在。每一步必不可缺,每一步都需认真对待,才能最终得到一个完美的结果。

  1、尽可能提取完全或降低样本复杂度,集中提取某个样本部位总蛋白,比如只提膜蛋白;

  2、保持蛋白处于溶解状态(有针对性的对裂解液的pH盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择);

  3、提取蛋白过程防止降解、沉淀等(最好冰上操作,并加入适量的蛋白酶抑制剂20124ES或磷酸酶抑制剂20109ES);

  4、减少样本的粘稠度,去除核酸等分子(全能核酸酶20156ES或采取超声处理);

  准确测定蛋白样本浓度,既能标准化电泳时蛋白上样量,又能更好的配合内参靶标对目的蛋白进行定量分析。

  选择合适的蛋白胶,能够更好的对目的蛋白进行分离及检测。原则:高浓度的蛋白胶适合分离小分子量的蛋白;低浓度的蛋白胶适合分离高分子量蛋白;梯度浓度胶可以兼容多种浓度的分离效果。

  转膜即将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体(例如NC膜)。蛋白转膜方法可大致分为湿转和半干转两种类型。用于Western blot的膜也有不同的类型及差异:

  由于SDS能够阻止蛋白与膜的结合,因此小分子蛋白转膜可不加SDS,同时甲醇浓度提高到20%;大蛋白易在凝胶里形成沉淀,转膜缓冲液中加入0.1%SDS,可增加蛋白的溶解性;由于甲醇易使SDS从蛋白上脱离,可降低甲醇的浓度(低至10%或者更低)来防止蛋白沉淀。

  封闭剂种类:脱脂奶粉(36120ES)、BSA(36101ES)、动物血清等,某些品牌特定的封闭剂等。

  2、某些抗体使用BSA封闭可能会产生比脱脂奶粉更强的信号,具体需阅读说明书 ;

  生物素化标记的抗体;磷酸化抗体检测蛋白磷酸化;碱性磷酸酶(AP)显色方法

  4、封闭时间:一般封闭1-2 h即可;后续可根据实验结果的背景强度来延长时间或更改封闭液种类。

  DAB即二胺基联苯胺,是过氧化物酶(如HRP)的生色底物,在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色的变化和积累,形成浅棕色不溶物。

  ECL( Enhanced Chemiluminescence)原理是鲁米诺被HRP和H2O2氧化,产生荧光,这个过程被发光增强剂加强,具有稳定性好,灵敏度高、背景低等特点。

  全膜再生液可有效去除PVDF或者NC膜上结合的一、二抗,同时温和作用维持蛋白的完整性不受影响。再次在同一张膜上进行孵育另一靶标的一、二抗,实现表达量检测以及最大可能的降低重新上样引起的误差。

  对于处理过或者是不同组织蛋白表达量的会涉及到量的变化,如何对这个表达量进行分析呢?此时借助不同软件,通过对Western blot的结果条带的灰度值计算,来做统计分析。比如比较简单的软件Image J可实现该功能:

  Image J软件,根据靶标蛋白以及内参蛋白的条带灰度,实现靶标蛋白的表达量分析。灰度的概念是使用黑色调表示物体,即用黑色为基准色,不同的饱和度的黑色来显示图像。采用ECL发光时,蛋白条带发出的荧光会曝光在胶片上,留下的黑色条带。

  应用互补:常配合ELISA来进一步分析蛋白功能(图10左)、免疫荧光IF对靶蛋白定位分析(图10右),以及配合流式FACs和组化IHC等技术共同研究。

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